【項目案例】MER | Nanopore完成首個超高質量海洋魚類基因組

2020年5月,中國水產科學研究院黃海水產研究所陳四清研究員團隊與北京百邁客生物科技有限公司合作完成了首個超高質量的綠鰭馬面鲀基因組,相關研究成果發表在知名期刊Molecular Ecology Resources上。本次研究基于納米孔測序技術(Nanopore)和染色體構象捕獲技術(Hi-C)完成的基因組僅包含242個Contigs,Contig N50高達22.46 Mb,并將99.44%序列掛載到20條染色體上,實現了海洋魚類基因組組裝質量質的飛躍!

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占比地球容量71%的海洋中蘊藏著豐富的生物資源,而海洋生物體內多糖和蛋白含量較高,以及部分海洋生物極易死亡腐敗從而引起DNA的降解,給高純度、完整的基因組DNA的獲取帶來了極大的困難。而海洋生物通常與陸生動植物相比更為復雜,組裝拼接的難度更大。本次研究使用Nanopore測序技術突破了這些瓶頸,完成了海洋魚類超高質量的基因組組裝!研究中使用104X Nanopore測序數據進行基因組組裝,通過Canu、WTDBG等多款軟件分別進行組裝,選取最優的組裝結果(主要從基因組大小,contig N50,組裝完整性,組裝準確性等方面評估)進行后續研究優化。研究者最終使用WTDBG軟件組的基因組版本結合Hi-C技術的進一步優化,組裝完成474.31 Mb基因組,并將99.44%的基因組掛載至20條染色體上,?ContigN50提升至22.46 Mb,且最長的Contig達到32.32 Mb!

圖1?基因組組裝流程

眾所周知,Contig N50是衡量基因組組裝質量好壞的一個重要指標,一定程度上來說,ContigN50值越高表示組裝的質量越好。與已有鲀形目基因組比較,綠鰭馬面鲀基因組組裝的ContigN50超過了同樣使用三代測序進行組裝的黃鰭東方鲀(Takifugu flavidus)的5倍,更是超過了翻車魚(Mola mola)的1000倍!

表1?鲀形目基因組比較

而與近年的一些魚類基因組ContigN50相比,綠鰭馬面鲀基因組組裝的連續性同樣也是表現超群。從表2中不難發現,近年來魚類基因組ContigN50水平基本在Kb與Mb之間徘徊,而本次使用Nanopore組裝的綠鰭馬面鲀直接上升了一個數量級,完成了連續性超強的優質基因組。

表2 近年已發表的魚類基因組

優秀的基因組不能只看連續性,完整性也同樣重要。研究者分別用Racon及Pilon進行兩輪及三輪糾錯來對WTDBG的組裝的基因組進行polish,并對糾錯前后基因組的完整性進行了多個方面的評估。

01、二代reads比對分析

利用bwa軟件將二代數據與參考基因組進行比對。結果顯示,二代reads雙端比對效率為97.41%,表明三代組裝基因組完整性較好。

02、核心基因完整性評估

CEGMA v2.5數據庫包含了真核生物458個保守的核心基因。使用CEGMA v2.5來評估最終基因組組裝的完整性。在最終版的基因組中,通過序列相似性(Identity > 70%)比對,共找到了458個核心基因中的442個(96.51%)。而在CEGMA v2.5所包含的更加保守的248個序列中,91.13%可以在組裝的基因組找到。

03、BUSCO評估

BUSCO v2中actinopterygii數據庫包含了真核生物中的4584個保守的核心基因。我們使用BUSCO v2.0軟件來評估基因組組裝的完整性。在我們組裝的基因中,共找到4,324個完整的BUSCO基因,其中單拷貝的4,213個,多拷貝的有111個;不完整的BUSCO基因有62個;未找到的有198個,BUSCO評估基因組完整度為94.33%(Complete BUSCOs/Total BUSCOs)。

評估結果均顯示完整度在94%以上,說明了基因組的整體組裝質量非常優異,將對后續的下游分析極為有利,具有無限的開發潛力。

總結

本次案例中的海洋經濟魚——綠鰭馬面鲀通過Nanopore平臺進行了超長讀長的基因組測序,使海洋生物組裝指標(contig N50)超越22 Mb!成為了目前為止我們所知的海洋魚類N50最高的基因組!同時評估結果也表明,組裝的準確度與完整性也非常高。

百邁客ONT平臺超強連續性基因組研究展示(部分)

結合往期以及如上表給大家展示的組裝數據不難看出,在一定組裝深度的情況下,Nanopore技術能帶來高水平的基因組,甚至還會出現新的驚喜!無論是動物植物還是微生物、無論是基因組轉錄組還是宏基因、無論是舊數據的更新還是高難度物種的破譯,Nanopore都能出彩表現~

截至目前,百邁客Nanopore平臺已經完成了近400種物種的DNA建庫測序工作,擁有大量的項目經驗!無論是技術還是項目經驗上,我們都實力過硬!期待越來越多可喜的結果交付到各位老師的手中~

Nanopore 官方認證證書

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