黃瓜是人們生活中常見的新鮮果蔬,深受大眾消費者喜歡。今天給大家推薦的這篇文章是前不久揚州大學陳學好老師課題組的最新研究成果“The major-effect quantitative trait locus Fnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber”,該研究報道了一個黃瓜果把長度調控的主效基因,并闡述其遺傳機制,最終該成果發表在國際知名期刊Plant Biotechnology Journal(最新IF=8.15)。該文章采用的思路和方法,從事植物發育類性狀研究的老師們可以借鑒,其中最重要的基礎工作BSA定位由百邁客生物提供。

針對本篇項目案例,大師兄將分為2部分給大家介紹,今天先為大家奉上該文章的解讀,從整體上了解文章的研究成果,第二部分大師兄將以其中主效基因的初定位和精細定位過程為基礎,對基因精細定位方法做詳細介紹,敬請期待。

研究背景

黃瓜果把長度(fruit neck length,FNL)是影響黃瓜品質和商業價值的重要性狀之一,由于果把無肉質組織、有苦味,而且易被折斷,因此現代育種的方向是短把黃瓜。關于黃瓜果把長度的遺傳特征研究較少,多篇文章報道了數個QTL位點,而且這些QTL解釋的表型變異率變化較大,但是相關基因一直沒有被克隆。

研究內容

本研究首先通過長果把品種Jin5-508和短把品種YN雜交構建的性狀分離群體(F2和F2:3),從F2中選擇果把長度極端個體構建DNA混池進行高通量測序,BSA分析和傳統遺傳圖譜共同在7號染色體上定位到一個主效QTL。再通過分離群體精細定位、基因表達分析、轉基因驗證等方法確定了調控果把長度基因CsFnl7.1。同時發現CsFnl7.1啟動子區域的多態性調控CsFnl7.1的表達水平。結合自然群體材料的多樣性分析,發現CsFnl7.1位點可能起源于印度。

文章思路

主要結果

01 黃瓜果把長度的遺傳特征

授粉30天后,雙親Jin5-508和YN黃瓜果把長度不再增長,于是選擇該時間節點作為果把長度鑒定的時期(圖1a)。Jin5-508果把長度顯著長于YN,這種差異是因為Jin5-508果把果肉細胞體積大于YN,而非細胞數增多(圖1b,c,d,e)。統計F1群體、回交群體和F2群體果把長度發現,F1群體表現出中親表型,而回交群體表型更偏向于輪回親本,F2群體表現出連續的近正態分布(圖1f),以上結果表明黃瓜果把長度是數量性狀。

圖1?黃瓜果把長度遺傳特征

02果把長度QTL的初定位—BSA方法+遺傳圖譜

作者在1231個F2群體(Jin5-508 × YN)選擇了長把和短把單株各50個,構建2個極端性狀DNA混池,對該混池及雙親進行高通量測序及BSA分析。親本測序深度分別為34x(Jin5-508)和20x(YN),混池測序深度分別為61x和52x。測序數據與黃瓜參考基因組9930比對,2個混池分別開發了342,496和399,764個SNP,基于SNP index算法,在chr7上定位到一個主效QTLFnl7.1?(閾值0.833),區間范圍9.98–14.61 Mb(圖2c)。

圖2?BSA定位結果

為驗證BSA的定位結果,作者在3個不同環境下調查了102個F2:3家系(Jin5-508 ×?YN)的表型,結果顯示F2:3表型也符合正態分布(圖3a)?;陔p親重測序數據,作者在7號染色體上開發了72個雙親多態標記(SNP和InDel),用這些標記合F2群體構建7號染色體的連鎖圖譜。結合F2:3群體3個環境的表型以及F2遺傳圖譜,共同定位到了1個主效QTL(圖3b),表型貢獻率在27.9%-32.7%。綜合BSA定位和遺傳圖譜定位結果,最終吧QTL Fnl7.1定位在7號染色體上2.85Mb的區間內。

圖3?F2:3群體表型變異及遺傳圖譜定位結果

03 Fnl7.1的精細定位

作者利用初定位側翼標記InDel01和SNP01對大規模F2單株(4000株)進行分型,篩選得到51個區間重組單株。在InDel01和SNP01區間內又開發了另外4個標記,對51個重組單株進行分型,共得到10種不同的單體型,基于個體表型及單體型數據,Fnl7.1被縮小到25.4kb的區間(標記InDel05和SNP01)(圖4c)。為了進一步縮小區間范圍(老師態度很嚴謹,佩服),作者又構建了一個更大規模的F2分離群體(7600個單株),利用InDel05和SNP01進行分型后又得到4個F2重組單株。F2重組單株自交得到4個F2:3群體,在InDel05–SNP01區間內又開發了4個多態SNP標記,用這些標記對F2:3群體進行篩選,發現有2個F2:3群體在標記區間內發生了重組。利用重組單株的表型及單倍型分型結果,將Fnl7.1定位在14.1kb的區間(圖4d),而在該區間內共有2個基因,分別為CsGy7G014720和CsGy7G014730(圖4e)。

圖4?Fnl7.1精細定位過程

04 Fnl7.1功能驗證

克隆雙親14.1kb定位區間,測序后進行序列比對發現共有17個SNP和InDel差異,部分變異位于基因間區、內含子區,而位于外顯子區的則為非同義突變,另外在CsGy7G014720啟動子區有多個變異。同時,作者發現InDel05(位于CsGy7G014720啟動子區)與Fnl7.1共分離。以上結果表明,CsGy7G014720(后續稱作CsFnl7.1)是最有可能的候選基因。

選擇雙親授粉后0-15天幼瓜進行CsFnl7.1的表達量分析,qRT-PCR結果顯示授粉后6個時間點,CsFnl7.1在雙親中表達差異不顯著,而且表達量表現出持續降低(圖5a)。但是,在授粉當天,CsFnl7.1在Jin5-508中表達量顯著高于YN。組織特異表達分析顯示,CsFnl7.1在果把中表達量最高(圖5b)。?

圖5?CsFnl7.1表達分析

05 CsFnl7.1啟動子多態性影響其表達

序列分析顯示,雙親CsFnl7.1啟動子區存在多處序列差異(25個SNPs和7個InDels),因此作者將雙親的啟動子進行了克隆,分別與GUS基因構建整合質粒,轉化煙草葉片進行啟動子活性分析。發現Jin5-508啟動子(pCsLEAJ)活性是YN啟動子(pCsLEAY)活性的4倍(圖6)。這與轉錄組分析結果一致(授粉當天CsFnl7.1在Jin5-508表達量顯著高于YN),從而說明CsFnl7.1表達受順式調控。

圖6?雙親CsFnl7.1啟動子活性比較

06? CsFnl7.1轉基因植株表現

為進一步驗證基因功能,作者將CsFnl7.1轉入短把品種“D8”中,得到3個T2代單株(OE4、OE7和OE8)。Southern雜交顯示OE4、OE7和OE8分別插入1、1和2個拷貝(圖7a)。與對照相比,3個轉基因個體CsFnl7.1表達量顯著提高,同時果把長度也更長,說明CsFnl7.1確實能夠影響果把長度(圖7b,c,d)。分析果把果肉細胞的個數和大小發現,轉基因個體比對照個體細胞更大,但細胞數在兩者之間沒有顯著差異(圖7e,f,g),從而說明CsFnl7.1是通過調控細胞伸展來影響果把長度。

圖7?CsFnl7.1轉基因個體表現

07? CsFnl7.1與細胞伸展相關蛋白存在互做

利用酵母雙雜技術,以CsFnl7.1蛋白為誘餌篩選與其互做的蛋白,結果顯示共得到53個陽性克隆,在這些蛋白中有多個與細胞伸展相關,包括CsDRP6和CsGLP1(圖8a)。體外pull down實驗顯示,融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕獲,而對照GST則不能(圖8b)。以上結果充分說明CsFnl7.1與CsDRP6、CsGLP1之間存在互做關系。

圖8?酵母雙雜及pull?down分析

08? Fnl7.1的地理分布及進化分析

作者收集了158份自然群體黃瓜材料,來自于東亞、歐亞大陸、印度、西雙版納等,含野生種和栽培種,東亞品種大多為長果把,而歐亞大陸品種大多為短把,而印度品種長果把和短果把品種數量相當,這也反映了Fnl7.1位點可能起源于印度。

利用Fnl7.1啟動區的變異信息,對158個品種進行進化分析,結果顯示所有品種可被分為4個group,其中group1和group2主要包含來自于歐亞大陸的端果把品種,而group3主要為來自于東亞的短果把品種,來自印度多個品種在3個不同group都有分布,以上結果也可以證實Fnl7.1起源于印度的假說。

總結

本文是一篇典型的基因克隆+驗證的優秀文章,從事農作物、蔬菜功能基因研究的老師可以引用參考。該研究最大的亮點是使用大規模F2分離群體,通過BSA分析+重組個體分析,就實現了基因的精細定位,從而避免了構建高代回交群體的繁瑣過程,極大地縮短了基因克隆的周期,減少了多年雜交、標記篩選等工作流程。當然,能夠采用這種策略,也與物種繁殖周期、產籽量、QTL貢獻率等多個因素相關(我們會在下期著重討論這些問題),本研究的物種和性狀特征符合上述要求,所以能夠快速拿到基因。在這篇文章之前,2018年陳學好老師在The Plant Journal(最新IF=6.14)上發表了一篇黃瓜耐水淹基因克隆驗證的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1?encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”,文章思路和方法與本文基本相似,也是采用大規模F2分離群體+BSA分析的方式,感興趣的老師可以參考學習。我們不難看出,只要方法選的對,再加上細致的研究工作,就可以持續發表高分文章!

提前劇透

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參考文獻

Xu, X., Wei, C., Liu, Q., Qu, W., Qi, X., Xu, Q.and Chen, X. (2020) The major-effect quantitative trait locusFnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber. Plant Biotechnol. J., https://doi.org/10.1111/pbi.13326

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