全長微生物多樣性

產品介紹

三代微生物多樣性是基于?PacBio 測序平臺,利用單分子實時測序(SMRT Cell)的方法對 marker 基因進行測序,之后通過對 CCS(Circular Consensus Sequencing)序列過濾,得到 Optimization-CCS 進行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,并進行物種注釋及豐度分析,可以揭示樣品的物種構成; 進一步進行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等等,可以挖掘?樣品之間的差異。

目前,微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區進行的。細菌主要是基于16S區,真菌主要基于18S區或ITS區(內轉錄間區),16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的DNA序列,18S rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA(18S rRNA)的DNA序列,ITS是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA內轉錄間隔區序列。這些序列中既有保守區又有可變區,保守序列區域反映了生物物種間的親緣關系,而高變序列區域則能體現物種間的差異。由于18S rDNA在進化速率上比較保守,在系統發育研究中較適用于種級以上階元的分類。常用作微生物分類研究的ITS分為ITS1和ITS2兩種。ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間,ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。由于ITS區在核糖體RNA加工過程中被剪切掉,不發揮功能作用,在進化過程中選擇壓力較小,進化速率約為18S rDNA的10倍,屬于中度保守的區域,利用它可研究種及種以下的分類階元。另外,也可通過選擇引物同時擴增18S rDNA和ITS,通過分析18S rDNA序列,先在較高級別上確定樣品的歸屬,然后根據ITS 序列,將真菌歸類到種或亞種水平。

我們對不同類型的樣品如:土壤、糞便、腸道、水體等,隨機挑選了30個項目對其進行物種注釋率進行研發優化,目前采用優化數據庫及注釋方法的策略,將其種水平平均注釋率提升到60%+。二代注釋到屬和種的平均比例為78%和6%,相同樣品采用三代進行注釋時,屬和種水平平均注釋率為95%和60%,注釋結果提升非常明顯。

測序數據量飽和度

三代微生物多樣性是基于PacBio測序平臺,利用單分子實時測序(SMRT Cell)的方法對marker基因進行測序。PacBio的CCS模式minPasses≥5,自我矯正,超高準確性。通過對校正后的CCS(Circular Consensus Sequencing)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,并進行物種注釋及豐度分析??梢越沂经h境樣品中物種構成,進一步進行Alpha Diversity、Beta Diversity和組間顯著物種差異分析等,可以挖掘樣品之間種類和豐度的差異。

統計數據結果顯示:單樣本5000條CCS即可達到飽和。

工作流程

建庫測序:

提取樣品總 DNA 后,根據 16S 全長引物 27F 和 1492R(及其他全長引物),合成帶有 Barcode 的特異引物,進行 PCR 擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫(SMRT Bell),建好的文庫先進行文庫質檢,質檢合格的文庫用 PacBio Sequel 進行測序。PacBio Sequel下機數據為 bam 格式,通過 smrtlink 分析軟件導出 CCS 文件, 根據 Barcode 序列識別不同樣品的數據并轉化為 fastq 格式數據。

生信流程:

數據預處理:將 PacBio 下機數據導出為 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具獲取)后,主要有如下3個步驟:

1)CCS識別:使用?lima v1.7.0軟件,通過barcode對CCS進行識別,得到的Barcode-CCS序列數據;

2)CCS長度過濾:使用百邁客公司自主研發的軟件,對Barcode-CCS進行過濾,得到有效序列;

3)去除嵌合體:使用?UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到 Optimization-CCS 序 列。

信息分析內容:劃分OTU、多樣性及差異性分析(具體見分析結果)。

結果展示

送樣要求

土壤:每管土壤含量大概0.25~0.5g,需保證送樣量在1~2g,若土壤含微生物較少,需增加送樣量

淤泥:4小時內常溫帶回實驗室中分裝至2mL EP管或凍存管中;或用PBS進行清洗,8000g離心10min收集沉淀,分裝于2 mL離心管中;每個樣品至少2g。

水體:2ml-5ml水體,取樣后4小時內(期間4 ℃避光保存)真空抽濾、富集菌體(平行重復 樣本可用同一濾膜過濾0.22μm或0.45μm)帶有富集菌體的干燥濾膜剪碎或折疊后保存在 2mL或5mL 無菌EP管中。

腸道內容物:在實驗對象死亡后,無菌條件下,取出整個腸道,用無菌解剖刀切取所需腸段的內容物。用無菌手術刀挖取內容物,并立即放在冰上進行分裝及標記。將已取的樣品分裝至2mL EP管(無菌)或凍存管(無菌)中,每管組織量為0.5~2g,每個樣品分裝2~3管備份。

糞便:帶上手套收集新鮮的糞便樣品,無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內部(避免表層中的腸道膜脫落細胞),外部容易污染且細菌DNA由于接觸空氣可能有降解,將已取的糞便樣品分裝至2mL EP管(無菌)或凍存管(無菌)中,每管糞便量為0.5~2g,每個樣品分裝2~3管備份。

所有樣本,液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸

生物學重復≥3

DNA樣本:

項目類型

濃度

總量

純度

完整性

微生物多樣性

≥10ng/μL(Qubit)

≥500ng

擴增條帶正常

主帶清晰,無降解或輕度降解

引物列表:

內容 項目 引物名稱 序列 擴增產物長度
全長 16S 全長 27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 1.5K
1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 1.5K
18S全長 EukA 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′ 1.8K
EukB 5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′ 1.8K
ITS 全長 ITS1 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 0.6-0.7K
ITS4 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 0.6-0.7K

案例展示

案例一:水體16S全長

2019年7月,德國的萊布尼茨動物園和野生動物研究所在Scientific Reports上發表運用16S全長的方法研究污水廠流入與流出水體的菌群特性的文章。

廢水處理對城市環境中的環境衛生至關重要。然而,廢水處理廠(WWTP)收集化學物質,有機物和微生物,包括來自各種來源的病原體和多重抗性細菌,這些細菌可能通過污水處理廠的污水釋放到環境中。為了更好地了解污水處理廠的微生物動態,我們使用全長16S rRNA基因序列對德國柏林污水處理廠2月、4月、7月和10月的污水廠流入與流出水體的細菌群落進行了研究和比較。通過污水處理廠處理過程,疾病相關細菌群體的相對豐度從有效性降低,只有軍團菌和鉤端螺旋體從流入物到流出物的相對比例增加。這表明污水處理廠雖然對腸道細菌有效,但可以富集并釋放其他潛在致病菌進入環境中。

案例二:硅藻18S全長多樣性

2017年美國的北卡羅來納大學通過對從西南極半島分離出的9種硅藻通過形態學表征性狀及18S測序鑒定硅藻種類。

研究表明鐵氧還蛋白,favodoxin,鐵蛋白,視紫紅質,質體藍素,替代線粒體氧化酶,細胞色素c6和ISIP基因存在于大多數(但不是全部)硅藻分支中。最終,通過研究基因庫及生理屬性,我們可以開始發現影響硅藻分布和豐度的其他細胞機制。

案例三:ITS全長多樣性

2019年,高通量測序技術的發展極大地有益于我們對微生物生態學的理解,但產生短讀取的方法受到物種水平分辨率和不確定性的影響。在這里,我們優化基于太平洋生物科學的元條碼編碼協議,涵蓋內部轉錄間隔區(ITS區域)和rRNA基因的部分小亞基,用于物種水平鑒定所有真核生物的陽離子,特別關注真菌(包括Glomeromycota)和Stramenopila(特別是Oomycota)。

基于對愛沙尼亞復合土壤樣品和模擬群落的測試,我們提出了最適合的簡并引物,ITS9munngs + ITS4ngsUni用于真核生物及其中的選定組,并討論了基于長讀取的真核生物鑒定的利弊。

常見問題

Beta多樣性四種距離算法的差異?

Beta?多樣性分析主要采用?binary jaccard、?bray curtis、?unweighted Unifrac(限細菌)、weighted Unifrac?(限細菌)4種算法計算樣品間的距離,那么這四種算法都有什么差別呢?

非加權的計算方法,主要考慮的是物種的有無,即如果兩個群體的物種類型都一致,表示兩個群體的樣本距離最??;加權方法,則同時考慮物種有無和物種豐度兩個問題。比如如樣品A3個物種a2個物種b組成,樣品B2個物種a3個物種b組成,則通過非加權方法計算,因為樣品A與樣品B的物種組成完全一致,都只由物種ab組成,因此它們之間的樣本距離為0。但通過加權方法計算,雖然樣品A與樣品B的物種組成一致,但物種ab的數目卻不同,因此兩個群體的β多樣性則并非一致。

基于獨立OUT的方法認為OTU之間不存在進化上的聯系,每個OTU間的關系平等;基于系統發生樹計算的方法,會根據16s的序列信息對OTU進行進化樹分類, 因此不同OTU之間的距離實際上有“遠近”之分。

微生物多樣性中OTU是指什么?

OTU(Operational Taxonomic Unit )即分類操作單元,是在系統發生學研究或群體遺傳學研究中,為了便于進行分析,人為給某一個分類單元(品系,種,屬,分組等)設置的同一標志。在微生物多樣性分析中,根據不?同的相似度水平,對所有序列進行OTU劃分,一般情況下,如果序列之間的相似性高于97%?(種水平)就可以把它定義為一個OTU,每個OTU代表一個物種。

PCA與PCoA的區別?

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一種分析和簡化數據集的技術,通過將方差進行分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上;主坐標分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一種與?PCA?類似的降維排序方法。PCoA與PCA的區別在于PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的分析,使用的是歐式距離,僅僅比較的是物種豐度的不同,而PCoA首先根據不同的距離算法計算樣品之間的距離,然后對距離矩陣進行處理,使圖中點間的距離正好等于原來的差異數據,實現定性數據的定量轉換。

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